Esquerra: representació de la vista lateral de l’estructura dimèrica de RappLS20. Dreta: tetramerització RappLS20, vista lateral del tetràmer unit al pèptid. Les fletxes vermelles indiquen els bucles que connecten les hèlixs H4 i H5. (C) Zoom de l'àrea al voltant de l'extrem N-terminal de l'hèlix H4, mostrant la inserció d'aquesta hèlix al monòmer oposat. L’homotetramerització causada per les interaccions foot-2-foot dels NTD de RappLS20 proporciona una explicació per a l'activació de RcopLS20. En absència del pèptid, els NTD es posicionen de manera que permetin la interacció amb RcopLS20. No obstant això, en unir-se el pèptid de senyalització, els NTD es desplacen cap a l'exterior, facilitant la formació de l'homotetràmer, provocant un canvi de la superfície d'interacció dels NTD que ja no estaria disponible per a les interaccions amb RcopLS20. A la dreta, l'equip de l'ALBA.
Cerdanyola del Vallès, 20 de novembre 2020 Els bacteris tenen mecanismes per establir comunicació entre cèl·lules. Això és especialment important en la conjugació bacteriana, un procés que els permet compartir material genètic entre ells. En molts casos és usada pels bacteris per transferir-se gens de resistència als antibiòtics i altres factors de virulència, augmentant d’aquesta manera la difusió de la resistència a antibiòtics.
Ara, un equip de recerca de l’ALBA ha descobert el mecanisme estructural mitjançant el qual dues proteïnes, Rap i Rco, actuen juntes per regular la conjugació. Rco és una repressora de la conjugació, mentre que Rap s’uneix a Rco i impedeix llavors la seva repressió de la conjugació, donant lloc a una activació del mecanisme de conjugació. Els principals resultats de l’estudi mostren que Rap conté una zona on un pèptid curt es pot unir, produint-li canvis estructurals que obliguen a la seva tetramerització, alliberant Rco perquè bloquegi la conjugació. La tetramerització es produeix a través d'una interacció que l’equip ha anomenat "foot-2-foot", que difereix significativament del model proposat per a d’altres proteïnes de la família Rap.
"Hem demostrat per primera vegada la interacció directa entre les proteïnes Rap i Rco i hem revelat el mecanisme pel qual la unió del pèptid a Rap impedeix aquesta interacció Rap-Rco, reprimint el procés de conjugació", explica Isidro Crespo, investigador a l'ALBA.
Nerea Bernardo, científica també de l'ALBA, afegeix que "mostrem com la proteïna Rap sola té forma dimèrica i que, quan s’hi uneix el pèptid, forma tetràmers dirigits pel domini N-terminal. A més, concloem que Rap s’uneix directament a Rco en absència del pèptid i, quan aquest darrer és afegit, allibera Rco de Rap. Això permet a Rco unir-se a la regió promotora de gens crucials per la conjugació, bloquejant-ne la seva expressió."
La informació de la base estructural del mecanisme d’interacció s’ha obtingut a través de la combinació de diverses tècniques de sincrotró. La cristal·lografia de macromolècules a la línia de llum XALOC d’ALBA ha mostrat l’estructura atòmica de la proteïna Rap i els canvis induïts per la interacció peptídica, suggerint la tetramerització. Això va ser confirmat amb estudis de SAXS (dispersió de raigs X a petits angles realitzats a NCD-SWEET d’ALBA i a BM29 de l’ESRF), SEC (cromatografia d’exclusió per mida) i AUC (ultracentrifugació analítica). "Aquest enfocament de l’estudi combinant les quatre tècniques ha estat crucial per descobrir el comportament d'oligomerització de Rap i dels que interactuen amb ella", comenta Roeland Boer, responsable de la línia de llum XALOC.
Finalment, van confirmar que la tetramerització produeix la dissociació de Rco, alliberant-la degut a la interacció Rap-pèptid. Els investigadors destaquen que conèixer el mecanisme d’inhibició de la conjugació ajuda a trobar estratègies clíniques per evitar la conjugació bacteriana i per tant, la propagació de la resistència als antibiòtics. Els resultats mostren que l'addició del pèptid produeix la dissociació del complex Rap-Rco, i Rco lliure bloqueja la conjugació. Per tant, seguint aquesta estratègia, els medicaments dirigits a Rap podrien millorar el bloqueig de la conjugació, evitant que els bacteris propaguin els gens de resistència i altres factors de virulència.
Els resultats representen un altre pas endavant cap a la prevenció de malalties, ja que aquestes proteïnes es troben en molts dels gèneres bacterians que són comensals o patògens dels humans, com Bacillus, Streptococcus i Enterococcus.
Referència: Isidro Crespo, Nerea Bernardo, Andrés Miguel-Arribas, Praveen K Singh, Juan R Luque-Ortega, Carlos Alfonso, Marc Malfois, Wilfried J. J. Meijer, Dirk Roeland Boer. Inactivation of the dimeric RappLS20 anti-repressor of the conjugation operon is mediated by peptide-induced tetramerization. Nucleic Acids Research, 2020, 48, 14 8113–8127. DOI:10.1093/nar/gkaa540
L’equip d’ALBA (Roeland, Nerea, Isidro) ha liderat l’estudi, amb ajuda de l’equip de la línia NCD-SWEET (Marc Malfois) i col·laboradors de Madrid, especialistes en conjugació bacteriana (Andrés Miguel-Arribas, Praveen K. Singh,Juan R. Luque-Ortega, Carlos Alfonso, Wilfried J.J. Meijer).
